沒有人知道傳染病的病因，更談不上有效的治療。科赫經常只能對患者和家屬說幾句安慰的話，因為他自己也不明白傳染病究竟因何而起，他也沒有有效的治療方法。科赫沒有坐以待斃，他不願意再眼睜睜看著自己的患者一步步走向死亡。
在那個叫沃爾施泰因的小村子裡，科赫建立了一個簡陋的實驗室。就是在這個小小的不起眼的實驗室中，科赫開始了自己關於病原微生物的研究。科赫的實驗室裡沒有什麼大型的科研設備，小鄉村中也沒有收藏著大量文獻的圖書館。他甚至也難以和其他同樣研究微生物的學者進行溝通討論，他唯一擁有的「大型」研究工具，是他的妻子送給他的顯微鏡。
在簡陋的實驗室裡，單槍匹馬的科赫沉浸在自己的研究中，只要有時間，他就將自己關在實驗室中，人們不明白科赫到底在幹什麼，甚至有人說他得了精神病。
1863年，法國微生物學家凱西米爾．達韋納發表了一篇論文。論文中，凱西米爾提到了炭疽病可以在牛與牛之間直接傳染。科赫在看到這篇論文後，更加仔細地研究了這個疾病。
炭疽是由炭疽桿菌所致，一種人畜共患的急性傳染病。人因接觸病畜及食用病畜的肉類而發生感染。臨床上主要表現為皮膚壞死、潰瘍、焦痂和周圍組織廣泛水腫及毒血症症狀，皮下及漿膜下結締組織出血性浸潤；血液凝固不良，呈煤焦油樣，偶可引致肺、腸和腦膜的急性感染，並可併發敗血症。
為了研究炭疽病的起因，他整夜整夜地在實驗室裡待著，甚至幾個星期都不邁出實驗室一步，像著了魔似的廢寢忘食。他的妻子終於忍受不了他對自己事業的執著，離開了他。為了證明炭疽菌就是炭疽病的罪魁禍首，科赫從死於炭疽病的動物的脾臟中提取出了組織液，再將組織液接種到正常健康的小鼠身上，被接種後的小鼠很快就感染上了炭疽病。
然而，科赫對這樣的實驗結果並不是十分滿意。
他想瞭解從未接觸動物的炭疽菌是否能引起炭疽病。因此，他提取了患了炭疽病的牛眼中的液體進行培養。科赫發現，當環境不利的時候，這些細菌會在自身內部產生圓形孢子（芽孢），芽孢能抵禦不良的環境，尤其是缺氧環境，而當周圍環境恢復正常時，芽孢又成了細菌。
科赫在純培養條件下繁殖了數代炭疽菌，當他將這繁殖了很多代後的炭疽菌接種到小鼠身上的時候，小鼠仍然感染了炭疽病。
1876年，科赫公開了他的發現。他去了弗羅茨瓦夫，進行了3天的公開表演實驗。他證明了炭疽桿菌是炭疽病的病因，首次提出了炭疽桿菌的生活史，即桿菌—芽孢—桿菌的迴圈，而能在土壤中長期生存的芽孢，就是造成炭疽大流行的罪魁禍首。
