萬曆二十八年（一六○○）徐光啟在南京遇見利瑪竇，他忙於趕回上海，來不及深談皈依的問題。三年後即萬曆三十一年（一六○三），他因事返回南京，拜會了羅如望神父。他進屋時在聖母像前禮拜，而且在首次聽到一些天主教的原理後，馬上決定信仰天主教。那一整天直到很晚，他一直安靜地思索著基督信仰的主要條文。他把教義的一份綱要─〈天主教要〉，還有利瑪竇神父的教義問答─《天主實義》的一個抄本帶回去閱讀。他請羅如望神父盡可能多地解釋某些段落，因為他必須在年底回家以前完成領洗。為了弄清他是否真正嚴肅地對待此事，神父要他每週一天來接受教誨。他回答說：我要一天來兩次。他確實這樣做了，總是準時到達。在他動身回家的那一天，他受了洗，正式成為天主教徒，教名保祿（Paul），神父們稱他為徐保祿。
次年，他再度參加會試，進士及第，被選為庶吉士，此後歷任翰林院檢討、少詹事兼河南道御史、禮部尚書兼文淵閣大學士。美國學者畢得信（Willard J. Peterson）認為，他可能是當時擔任官職最高的天主教徒，他的達官貴人身分並不影響他對天主教的虔誠信仰，在以後的三十多年中，他多次運用自己的財富、才智和政治影響，支持和推動天主教會活動，正如利瑪竇所言，他成為天主教在中國的「柱石」。
萬曆四十四年（一六一六），禮部侍郎、署理南京禮部尚書沈漼向朝廷上疏，主張排斥天主教，以「崇正學，黜異端，嚴華夷」為藉口，揚言天主教「有窺伺之心」，「有傷孝道」，「私習曆法」，「傷風敗俗」，請求朝廷禁止天主教。徐光啟挺身而出，寫了〈辯學章疏〉，維護天主教：「彼國教人皆務修身以事上主，聞中國聖賢之教，亦皆修身事天，理相符合，是以辛苦艱難、履危蹈險，來相印證。欲使人人為善，以稱上帝愛人之意。其說以昭示上帝為宗本，以保救身靈為切要，以忠孝慈愛為工夫，以遷善改過為入門，以懺悔滌除為進修。」他的結論是：「諸陪臣所傳事天之學，真可以補益王化，左右儒術，救正佛法也者。」所謂「左右儒術，救正佛法」云云，其實就是「易佛補儒」。
萬曆後期，明朝與後金的戰事屢遭敗績，徐光啟多次上疏，建議「京師宜築重層墩臺，鑄巨炮；薊州、遼左諸臺堡宜仿此修建」。所謂「鑄巨炮」，就是引進西洋的火炮技術，大量製造。在一份奏疏中說：「臣之愚慮以為，勘定禍亂，不免用兵；用兵之要全在選練……選用教師，群居聚處，日夜肆習之，又博求巧工利器，如車乘、甲胄、軍火、器械等，盡法製造，以配給之。」在另一份奏疏中，詳細設計了「都城萬年臺」的計畫：「臣再四思維，獨有鑄造大炮，建立敵臺一節，可保無虞。造臺之法，於都城四面切附門垣，用大石壘砌，其牆極堅極厚，高與城等，分為三層，下層安置極大銃炮，中層、上層以漸差小。臺徑可數丈，每臺約用慣習精兵五百人。其最大炮位平時收藏內府，第二三等藏之戎政衙門。聞有警急，既行修整安置，賊寇攻圍，相機施放，雖有大眾，一時殲滅矣。」此後又遵旨陳述「急切事宜」六條，其中「議徵求」條說：「軍中所需精好器甲，大小神器及軍火器材料，教師巧匠，有遠方所有，近地所無者，須一一徵求，以便傳授製造。」主要是指「西洋大小諸色銃炮」，亦即通常所說的西洋大炮。可惜的是，這些建議沒有得到採納。
